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今年的诺贝尔生理学或医学奖得主是如何发现细胞探测和适应氧气供应的分子机制的?

2019-10-09 09:02:53 Robert Young 阅读量:174

【导读】北京时间10月7日,2019年诺贝尔生理学或医学奖揭晓。奖项授予了美国医学家威廉·凯林(William G. Kaelin Jr.)、英国医学家彼得·拉特克利夫(Sir. Peter J. Ratcliffe)和美国医学家格雷格·塞门扎(Gregg L. Semenza),以表彰他们“发现了细胞如何感知和适应氧气变化机制”。他们将平分900万瑞典克朗(约合人民币650万元)的奖金。


▌本文授权转载自“我爱生化微信公众号


今天下午,我还在微信朋友圈里斗胆预测今年诺贝尔生理学或医学奖很可能会授予发现和应用CRISPR-Cas系统以及发现和揭示表观遗传机制的科学家呢!但怎么也没想到,晚上6:15左右得知授予了发现细胞如何探测和适应氧气供应的美国科学家小威廉姆·凯林(William Kaelin Jr.)、格雷格·塞梅扎(Gregg Semenza)和英国科学家彼得·拉特克利夫爵士(Sir Peter Ratcliffe)。虽然这次在国庆出去讲代谢课程的时候,还重点讲到了相关机制,而我的《生物化学原理》第三版在糖酵解这一章也有专门的内容介绍,但是它能得诺贝尔奖真的出乎预料啊!

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不过静下心来仔细想一想,这三位科学家的贡献也绝对值得获奖!大家知道,地球在46亿年前刚刚诞生的时候是缺乏氧气的,等到38亿年有生命的时候也是没有氧气的。直到22亿年前,地球上出现了光合有机体,于是终于有了氧气,而氧气的出现大大地推动了地球上生物的进化,因为富能生物分子通过有氧代谢可释放出更多的能量,产生更多的ATP。例如,1分子葡萄糖在无氧条件下分解,只能为细胞产生2个ATP,但在有氧条件下彻底分解,可为细胞产生至少32个ATP。经过这么多年的进化,氧气对地球上的生命太重要了!而我们人类在现代生物学问世的时候,就知道了这个星球上除了一些厌氧生物以外,其他生命是一直需要氧气来维持的,但是细胞究竟如何适应氧气供应变化的分子机制并不清楚。下面,我们就一起来看一看,人类是如何一步一步地揭示氧气对生物的重要性以及这三位科学家又是如何搞清楚细胞探测和适应氧气变化的分子机制的。


 一、氧气与动物生命


1770年代初期,瑞典科学家卡尔·谢勒(Carl Scheele)确定,根据他的计算,大约有四分之一的空气是他所说的“饱腹感”或“火气”,也就是说属于大气中允许物质燃烧的成分。几乎在同一时间的英国,约瑟夫·普里斯特利(Joseph Priestley)还找到了一种净化这种以前未知的气体的方法,称其为去火空气。 很快, Antoine Lavoisier与Scheele、Priestley同时在巴黎进行了分离该物质的实验,而Lavoisier给气体起了我们今天所熟知的名字——Oxygen(氧气)。


在在氧化反应中,氧气是动物生命所必需的,氧化反应促使食物中的营养物质转化为通用能量货币ATP。1858年,路易斯·巴斯德(Louis Pasteur)第一个证明动物细胞中氧气的使用存在复杂的平衡,并且发现细胞使用多种途径来完成能量转换。在过去的75年中,有两位科学家因为关于动物体内氧气感应的机制发现而获得过诺贝尔奖:一位是在1931年因发现有关细胞呼吸酶的奥托·沃堡(Otto Warburg),另一位是在1938年因发现神经系统在呼吸中对氧气反应起作用的科尼耶·海曼斯(Corneille Heymans)。然而,在整个20世纪的大部分时间里,人们并不清楚细胞如何在基因表达的水平上调节对氧通量的适应性。

 

 二、适应氧气变化


在几乎所有动物细胞中,快速响应并适应氧气利用率变化的能力至关重要。从分子分类学的研究中可以清楚地看出,在进化过程中,随着动物开始将自身组织成多细胞三维结构,这种对氧通量的反应已不仅仅是细胞自主反应,允许单个细胞内进行代谢适应,它也使复杂的生理反应得以发展。细胞需要以多种自主方式适应氧气水平的变化,特别是通过调节其代谢率。当我们在组织和器官的水平上检查这种反应时,会发现多细胞生物既需要重塑组织,以适应变化的氧气水平,又需要使整个生物适应以补偿氧合作用的变化。例如,在高海拔的人类中,肾脏中的特殊细胞会感应到血液中氧气水平的变化,这些特殊细胞会产生并释放促红细胞生成素(EPO)。该激素激活骨髓中的红细胞生成,进而帮助我们适应较低的氧浓度环境。


动物可能会暴露在低氧环境中,但重要的是,组织中的氧含量也会发生变化。动物体内的组织氧水平在空间和时间上都不同。这种变化发生在正常的生理事件(如运动过程中骨骼肌中有效氧的下降)以及诸如癌症和感染之类的病理过程中。从1970年代和1980年代的研究中可以明显看出,氧分压的这些局部和瞬时变化可通过基因转录的变化,调节细胞和组织中的关键适应性反应。这些基因调节反应改变细胞代谢,并控制基本的发育、再生和防御过程,包括诸如血管生成以及炎症和发育等各种过程。


动物细胞感知不同浓度氧气的能力,以及因此重新设置其基因表达模式的能力,对于几乎所有动物的生存都是必不可少的。由这些途径控制的氧激活信号传导途径影响至少300个基因,这些基因属于各种各样的调节网络。这些分子途径遍及许多生理过程,从器官发育和代谢稳态到组织再生和免疫,在包括癌症在内的许多疾病中都起着重要作用。

 

三、氧气与促红细胞生成反应

几乎可以肯定,任何对动物生命极为重要的信号传导途径都将涉及许多微调层面以及与其他分子途径的交叉点,因此氧气反应途径也不例外。


格雷格·塞梅扎、威廉·凯林和彼得·拉特克里夫的基本发现都围绕缺氧诱导转录因子(hypoxia-inducible factor,HIF)的作用。这一因素的发现源于莫里斯·邦杜兰特、马克·库里和海梅·卡罗等人在1986年和1987年所做的工作。他们的研究表明,缺氧会导致肾脏EPO的转录水平增加。这一发现又可以追溯到1882年法国生理学家保罗·伯特(Paul Bert)的实验,他首先展示了缺氧的心血管效应,并且是第一个表明暴露于高海拔地区会增加红血球的数目。

 

 四、HIF的分离纯化

一旦认识到EPO基因显示出缺氧诱导的转录反应,下一步就是确定EPO基因在调节区域中对氧气敏感性负责的特定DNA碱基序列。Semenza决定使用包含人类EPO基因的不同大小的DNA片段的克隆,来追踪转基因小鼠中EPO基因的转录调控元件。  Semenza及其同事首先证明,一个覆盖EPO编码序列的4 kb区域,再加上一些小的5'和3'侧翼序列,可导致在所有分析的转基因组织中产生EPO,最终导致循环EPO水平升高并导致多囊性红细胞增多症 。接下来,他证明了更长的EPO基因调控区含有6kb的5'侧翼DNA,能够在肾脏中诱导EPO的诱导表达。这项工作指出了EPO对氧气的复杂转录调控,包括正调控和负调控。


一年后的1991年,Semenza发表了另外两项研究,这些研究增加了有关EPO基因调控的重要信息:(1)DNA酶I超敏感性研究显示了EPO 3'侧翼DNA有一个小区域,该区域至少结合了几个核蛋白因子。其中两个是由贫血在肝脏和肾脏中诱发的;这个小区域能够在体外瞬时表达测定中起缺氧诱导的增强子的作用;(2)大约在同一时间,彼得·拉特克利夫爵士和杰米·卡罗爵士的实验室的研究报告了EPO基因的顺式作用DNA元件3'的存在,该DNA元件对转染到培养的肝癌细胞的报告基因的表达具有氧响应性。


上面的工作导致Semenza在1992年发现了EPO基因3'端大约50bp的增强子,可用于在培养细胞中引发缺氧诱导的报告基因表达。这种增强字被Semenza称为缺氧反应元件(HRE),与肝癌细胞中的几种核蛋白因子结合:一种是组成型的,而另一种是由缺氧水平诱导的。因此,后者被Semenza称为HIF。


Ratcliffe和Semenza都能够证明,EPO 3'端增强子可以在多种哺乳动物细胞类型中驱动缺氧诱导的报告基因表达。这表明,参与调节EPO基因的氧分子机制在多种动物细胞中均很活跃,这一发现为确定这种新型转录因子代表了用于氧传感的细胞基本机制的一部分提供了可能。随后的氨基酸序列分析和纯化蛋白的随后cDNA克隆显示,HIF本身是一个异源二聚体,由两种不同的基因产物组成。这些成分中的第一个是HIF因子的氧敏感部分,由Semenza命名为HIF-1α;第二个成分是组成型表达的基因,最初称为HIF-1b,直到后来发现该第二个成分先前已被克隆和描述为芳烃受体核转运子(aryl hydrocarbon receptor nuclear translocator,ARNT)。ARNT蛋白可与许多其他因子形成异源二聚体,并且由于其表达对氧气不敏感,因此很快清楚地发现HIF-1α才是HIF复合物中氧气反应性的调节剂。

 

五、 HIF系列扩大了


与HIF-1α高度相关的蛋白质是由四个不同的小组分别克隆的,分别是藤井佳明、Werner Risau、Christopher Bradfield和Steven McKnight。它最初有许多名称,包括一个仍然常用的名称(HIF-2a),但是该基因被正确命名为EPAS1。  EPAS1基因编码的蛋白质与HIF-1α具有高度的序列同源性,并且还以异原二聚体的形式与ARNT结合,具有HIF-1α一样的对缺氧的敏感性,并且具有与HIF-1α基本相同的调控机制。

但是,HIF-1α和EPAS1在功能上存在显着差异。小鼠中HIF-1α基因的缺失产生清晰的表型,即妊娠中期致死率。但是Epas1基因缺失的表型变化很大,这可能是由于遗传背景的差异所致。另外,有大量证据表明,某些缺氧反应完全受一种或另一种对氧敏感的同工型HIF控制。

 

六、 HIF的修饰是翻译后的,涉及VHL抑癌基因


包括Ratcliffe在内的许多实验室获得的数据表明,HIF-1α水平本身受蛋白质稳定性变化的调节,而不受基因转录或蛋白质合成变化的调节。包括卡罗(Caro)和弗兰克·布恩(H. Frank Bunn)在内的许多研究小组进一步证明,HIF-1α通过泛素-蛋白酶体途径降解,并且以氧依赖性方式发生。这项工作还确定了HIF-1α中负责其氧依赖性降解的特定结构域。


大约在此时,Kaelin的研究小组在1995年发表了第一个VHL抑癌基因全长序列,并表明将野生型VHL重新引入肾癌细胞系可阻止该细胞系形成肿瘤。Kaelin和许多其他小组一直在研究VHL基因及其与某些具有某些癌症遗传易感性的家庭的联系。  Kaelin的论文确立了VHL是一种抑癌基因,其活性可以抑制VHL突变患者细胞的肿瘤生长。 1996年,在表征VHL基因的过程中,Kaelin小组与Mark Goldberg小组之间的合作研究表明,许多HIF靶基因在VHL突变细胞系中过表达。这一发现表明,HIF应答和VHL相关的肿瘤发生的两个途径可以以某种方式联系在一起。


接下来,有关VHL功能的重要线索是与VHL蛋白结合的蛋白的鉴定。  Richard Klausner及其同事以及Kaelin及其小组在1995年发现VHL与转录延伸因子(延伸蛋白 B和C)相互作用。Marston Linehan及其同事证明,VHL是与Cul-2蛋白复合形成的,这是蛋白质泛酰化的一个因素。Kaelin随后重复了这一发现。由于延伸蛋白C和Cul-2与Skp1和Cdc53的结构相似,Skp1和Cdc53是已知的靶向特定蛋白的泛素依赖性蛋白水解的因子,因此这些观察结果揭示了VHL与蛋白降解之间的潜在联系。

 

 七、HIF被VHL靶向进行泛酰化和蛋白水解


虽然在1996年至1998年期间,已经清楚了HIF-1α和EPAS1水平在有氧状态下被蛋白酶体降解迅速下降,但仍不清楚在低氧状态下如何抑制该过程。难题的一个遗漏部分是泛素E3连接酶,怀疑与靶向HIF-1α降解有关。在这里,Ratcliffe及其同事在一篇具有里程碑意义的论文中提供了1999年的关键突破,他们证明VHL复合物参与了HIF-1α的蛋白水解作用。他们和其他人随后证明,VHL在此过程中充当泛素E3连接酶复合物的识别组分。


在这一点上,剩下的一个关键难题是氧气如何调节VHL与HIF-1α的相互作用和随后的HIF-1α降解。好在Maxwell等人的论文指出,VHL-HIF-1α相互作用需要一种既依赖于氧气又依赖于铁的活性。这一发现开始了对这一机理的探索:既可以实现与VIF结合的HIF-1α的氧依赖性化学修饰,也可以激活催化该反应的酶。


那时,已知氧依赖性蛋白羟基化发生在常见的胶原蛋白中,并且已知是由胶原脯氨酰4-羟化酶介导的。因此,怀疑HIF-1α中脯氨酸残基的氧依赖性羟基化可能赋予了允许VHL结合所需的构象变化。事实就是如此。  2001年,Ratcliffe和Kaelin实验室同时报告了HIF-1α的ODD域内两个脯氨酸残基的氧依赖性4-羟基化增加了对HIF转录因子的VHL复杂结合的亲和力,描述此事的两篇论文背靠背出版。

 

 八、氧依赖性开关


脯氨酸羟基化需要氧气,因此揭示了HIF-1α和EPAS1蛋白质的翻译后调控的精妙机制:在没有氧气的情况下,不会发生羟基化,并且VHL无法识别HIF-1α。因此,HIF-1α不会泛酰化,因此可以避免被蛋白酶体降解并保持完整。然后它可以积累并转录激活缺氧诱导的基因表达。


2001年发现了第二种依赖氧气的机制,这次不是针对HIF-1α降解,而是抑制其作为转录因子的活性。Semenza和他的小组是第一个鉴定涉及的因子,称为FIH-1(对于“ 抑制HIF的因素”。  FIH还是一种氧依赖性羟化酶,在这种情况下,它会羟化HIF-1α和EPAS1的N端激活域(NTAD)中的天冬酰胺残基;  Murray Whitelaw和Richard Bruick发现这种羟基化会干扰p300转录共激活因子的招募。这样,氧气不仅可以通过其ODD结构域的脯氨酰羟化促进HIF-1α降解,而且可以抑制任何逃避VHL依赖性降解的HIF-1α或EPAS1的转录功能。因此,HIF活性不是一个独立的机制,而是两个独立的机制,用于依赖氧的翻译后抑制。这表明保持HIF水平是由细胞中的氧气水平正确和精确调节的。


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九、 HIF控制途径的广泛意义


此后,许多小组的工作表明了HIF途径的稳定性及其在调节氧影响的基因表达中的核心作用。自从最初的寻路发现以来,Semenza、Ratcliffe和Kaelin仍然是这项工作的主要人物。他们参与了HIF途径分子生物学的进一步阐明,并且也加深了我们对缺氧反应在健康和疾病中所发挥的生理作用的理解。


调节HIF-1α稳定性的脯氨酸羟化酶的发现使得寻找羟化酶抑制剂来增加HIF的水平成为可能。现在,这为药理发现开辟了新途径。实际上,许多通过抑制PHD酶来提高HIF功能的潜在药物在临床试验中已经取得了非常好的效果,最近的一系列出版物也证明了它们在治疗贫血方面的临床功效。


抑制HIF途径的未来应用也即将出现。这些被设想为减缓由VHL突变诱导的某些癌症进展的方法。其中之一是EPAS1功能的特定阻滞剂,最近被Kaelin及其同事描述为能够减慢动物模型中VHL突变细胞的肿瘤生长。


从药理学角度讲,HIF功能增强可能有助于治疗多种疾病,因为HIF已被证明对于免疫功能,软骨形成和伤口愈合等多种现象至关重要。相反,抑制HIF功能也可能有许多应用:在许多癌症以及某些心血管疾病中,HIF的水平都会升高。因此,很可能我们才刚刚开始获得这些诺贝尔奖获得者的发现,因为很明显,对细胞、组织和生物体中氧气的反应是动物最重要的生理适应之一。

 

 参考文献:

1.Beck, I., Ramirez, S., Weinmann, R., and Caro, J. (1991). Enhancer element at the 3′-flanking region controls transcriptional response to hypoxia in the human erythropoietin gene. J Biol Chem 266, 15563-15566.2. 

2.Bert, P. (1878). La Pression Barométrique: Recherches de Physiologie Expérimentale. (Paris: G. Masson).

3.Bert, P. (1882). Sur la richesse en hemoglobine du sang des animaux vivant sur les haut lieux. Comptes rendus de l’Académie des Sciences 94, 805-807.

4.Bondurant, M.C., and Koury, M.J. (1986). Anemia induces accumulation of erythropoietin mRNA in the kidney and liver. Mol Cell Biol 6, 2731-2733.


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